如何构建国自然框架，一篇m6A玩转经典Wnt信号通路告诉你！

2020年国自然的初审已经结束，经初审，共受理项目申请267534项，不予受理项目申请2137项，从这个数据我们可以看出基金申请的关卡主要还是在复审啊，研究内容是否有价值，有新意都会在复审中进行评判。国自然申请主题紧靠热点不会落伍，但容易落入俗套，如何在众多的研究热点中脱颖而出，这就需要有新意了。比如今天我们要给大家分享的这篇由国自然和浙江省自然资助的，今年4月份发表在EMBO reports（IF=8.38）上的文章，研究团队（浙江大学医学院高向伟课题组）就将当下的国自然研究热点m6A甲基化修饰、干细胞、Wnt信号通路进行了联合分析。

1. 简介

m6A甲基化修饰是RNA转录后修饰中最常见的一种，通过参与调控RNA的可变剪接、翻译、降解等，影响干细胞分化，生长发育及癌症发生发展等，近几年，关于m6A甲基化修饰的研究热度持续不减。干细胞又被称为“万能细胞”，是一类具有自我更新能力、高度增殖和多向分化潜能的细胞，是当前医学领域和生物医学领域的研究热点之一。

Wnt信号通路是一个复杂的蛋白互作网络，参与胚胎发育、组织稳态及细胞癌变等过程，Wnt信号通路是明星通路，对于它的研究从未停止过。这三大热点，哪一个单独拎出来都足够吸引眼球，那么把它们三个联合起来研究，又会撞出怎样的火花呢？接下来，我们详细学习下这篇文章，争取在后面自己的研究中能够从中取其精华去其糟粕。

2. 文章技术路线

3. 文章假说图

注：A：正常情况或Wnt信号失活情况下，AXIN、APC和GSK3β组成的破坏复合物能降解β-catenin蛋白，使其在胞质中维持较低水平，Wnt信号下游调控失活。B：Wnt信号被激活时，破坏复合物失去对β-catenin蛋白的降解能力，YTHDF1蛋白表达上调，通过识别TCF4等靶基因3’-UTR的m6A促进靶基因翻译，进而提高β-catenin活性，β-catenin转位到细胞核，与转录因子作用激活下游靶基因，调控肠上皮再生和肿瘤发生。C：APC突变，破坏复合物失效，YTHDF1蛋白表达上调，其下游调控模式与Wnt激活状态类似。注意：研究结果部分的TCF7L2就是假说图中的TCF4.

4. 研究结果

1）YTHDF1表达分析

为探讨m6A修饰在Wnt调节的肠道稳态中可能行使的功能，研究人员利用Wnt3a活化Wnt信号通路，发现YTHDF1翻译被激活，蛋白水平显著上调。APC失活突变能结构性激活β-catenin，为探讨APC突变对YTHDF1的表达调控，过表达APC，结果显示APC能与YTHDF1 mRNA 5’-UTR结合，抑制其翻译，下调蛋白水平。（这里的翻译水平检测用的是多聚核糖体分析技术，该技术通俗来讲就是根据mRNA上连接的核糖体数目来判断翻译效率）

2）YTHDF1对肠上皮再生的影响

肠上皮刺激后再生是wnt信号驱动的过程，对小鼠进行辐射处理，结果显示YTHDF1表达模式与增殖标志物c-Myc非常相似。正常小鼠肠隐窝在辐射3天后快速更新再生，而YTHDF1敲除小鼠表现出明显的恢复能力缺陷，同时Lgr5、Fzd7和Myc等Wnt相关基因表达下调，提示YTHDF1对wnt信号驱动的肠再生至关重要。

3）YTHDF1对肿瘤发生的影响

考虑到YTHDF1在肠道肿瘤中上调，研究人员分别用APC突变小鼠和CRC小鼠模型检测YTHDF1在Wnt驱动的肿瘤发生中的作用，结果均显示敲除YTHDF1后，小鼠的肿瘤数量、大小均显著下降，提示YTHDF1促进肠道肿瘤发生。

4）YTHDF1对肠干细胞干性的影响

对肠道中YTHDF1的表达模式进行分析，发现YTHDF1在干性强的细胞中高表达。随后根据标志物Lgr5+选择性敲减小鼠肠干细胞中的YTHDF1，在Wnt3a条件培养基下培养来自干细胞的类器官（organoids），结果显示敲减YTHDF1，类器官出芽，干性降低，而重新表达YTHDF1，类器官恢复干性，提示YTHDF1缺失引起的肠道缺陷与肠干细胞功能障碍有关。 

5）YTHDF1靶基因分析

接下来，研究人员联合m6A-seq和RIP-seq，找到了YTHDF1的潜在靶基因（与YTHDF1结合，且有m6A甲基化修饰的mRNA）。因为YTHDF1能影响mRNA翻译，因此运用Ribo-seq分析了YTHDF1敲减后靶基因翻译的变化，进一步分析发现翻译下调的靶基因m6A甲基化水平高，同时甲基化修饰的mRNA翻译效率低，提示YTHDF1通过m6A甲基化修饰影响靶基因的翻译。（Ribo-seq即核糖体印迹测序，它跟前面的多聚核糖体分析技术一样，也是分析mRNA翻译水平的，主要根据mRNA中被核糖体保护的RNA片段多少来判断翻译效率）

KEGG通路富集分析显示YTHDF1靶基因与干细胞多能性相关，且是Wnt信号通路组分，在YTHDF1敲减后表达均下调，提示Wnt信号组分是Wnt激活过程中YTHDF1的主要靶点。

对靶基因TCF7L2进行深入分析发现，敲减YTHDF1，TCF7L2翻译被抑制，蛋白水平下降。而Wnt3a处理能显著促进了TCF7L2翻译，提高其m6A修饰水平，并促进YTHDF1与其结合。此外，功能回复实验表明高表达TCF7L2能挽救YTHDF1敲减引起的β-catenin活性下降，逆转YTHDF1缺失引起的干性损失，提示TCF7L2在YTHDF1参与调节的Wnt通路及肠干细胞干性中起作用。

6）临床应用分析

最后研究人员选择性敲减小鼠肠干细胞中的YTHDF1，发现YTHDF1缺失能显著降低的肿瘤数量和大小。同时Kaplan-Meier生存分析显示敲减YTHDF1的APC突变小鼠生存时间更长，提示YTHDF1可以作为肠道肿瘤治疗靶点。

5. 结论

文章亮点在于通过构建多种小鼠模型，运用多种组学技术，包括表观组的m6A-seq，转录组的RNA-seq，翻译组的多聚核糖体分析技术和Ribo-seq，以及RIP-seq，将时下研究热点m6A甲基化修饰、干细胞、Wnt信号通路进行了联合分析，可谓非常新颖。

虽然文章工作量很庞大，但很多因果关系并未能说清楚，比如Wnt信号激活时为什么YTHDF1蛋白表达上调？TCF4等靶基因是如何提高β-catenin活性的？细胞核内的β-catenin激活了哪些下游基因的转录？也就是说文章存在验证性不足，有堆砌数据之嫌。大家以后在申请国自然，特别是想往国自然热点上靠的时候，可以借鉴文章的整体研究思路以及研究方法，当然验证性不足这一点需要引以为鉴。

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